e545

2009年第54卷第9期:1250~1261

《中国科学》杂志社

SCIENCEINCHINAPRESS

论文

引用格式:王广力,何舜平,黄松,等.美姑脊蛇Achalinusmeiguensis线粒体基因组全序列及系统发育地位研究.科学通报,2009,54(9):1250~1261

WangGL,HeSP,HuangS,pletemitochondrialDNAsequenceandthephylogeneticpositionofAchalinusmeiguensis(Reptilia:

Squamata).ChineseSciBull,2009,54(10):1713―1724,doi:10.1007/s11434-009-0160-0

美姑脊蛇Achalinusmeiguensis线粒体基因组全序列及

系统发育地位研究

王广力①,何舜平②,黄松③,何苗①,赵尔宓①④*

①四川大学生命科学学院,成都610064;

②

中国科学院水生生物研究所,武汉430072;

③

黄山学院生命与环境科学学院,黄山245041;

④

中国科学院成都生物研究所,成都610041

*联系人,E-mail:zem006@

2008-10-21收稿,2009-03-13接受

摘要报道了美姑脊蛇Achalinusmeiguensis线粒体基因组全序列.美姑脊蛇线粒体全序列长

17239bp,由22个tRNA,2个rRNA和13个蛋白质基因及2个非编码的控制区或D-loop组成,存

在着基因重排现象.对已报道蛇类线粒体基因组全序列进行比对分析后,发现一些蛇类线粒体

基因组进化规律:双控制区现象在爬行动物进化历史中独立地发生,有不同的演化历史;tRNA

假基因是在真蛇下目(Caenophidia)中进化形成的;TΨC臂的相对较短(一般少于5bp)和缺失

“DHU”臂造成蛇类tRNA较短.通过MP和BI分析确定美姑脊蛇系统发育位置应该位于瘰鳞蛇

Acrochordusgranulatus和其他真蛇下目蛇类之间,而不应该属于游蛇科Colubridae或者眼镜蛇科

Elapidae.由于美姑脊蛇与真蛇下目中蝰科Viperidae、游蛇科以及眼镜蛇科之间的单系性都被统

计检验拒绝(P<0.01),由此认为美姑脊蛇所在的闪皮蛇亚科(Subfamily,Xenodermatinae)应该提

升到科或者更高的分类阶元.依据系统发育统计检验结果,我们选择Bayesian树来进行分歧时

间的估算.原蛇下目与真蛇下目的分化时间为109.50Mya;而瘰鳞蛇与其他真蛇下目种类的分

化时间为106.18Mya;美姑脊蛇的分化时间在103Mya;蝰科与眼镜蛇科和游蛇科构成的单系

群的分化时间发生在96.06Mya.

关键词

美姑脊蛇

线粒体全序列

系统发育

分化时间

在不同动物类群中,线粒体基因组在基因结构

和基因排列方式等方面均显示了极大的多样性,这

种多样性可能反映了真核细胞不同的进化路线[1].就

目前的研究而言,线粒体基因组是一个能够从基因

组水平上来分析动物系统发生的分子标记,可以从

线粒体基因组序列信息、基因组成及基因排列方式等

进行多方位的分子进化研究.因而线粒体基因组全

序列成为研究动物分子系统发生最有力的证据之一

[1].蛇的线粒体基因组大体构造与其他脊椎动物相似,

2个rRNA,22个左右的tRNA和13个左右的蛋白编码

基因,至少一个非编码区(controlregion),但是蛇类

线粒体全序列在其组成、结构与功能等方面又有着一

些与众不同的特点,如紧凑的基因结构、双控制区、

缩短的tRNA以及较快的进化速度等[2~5].

脊蛇属GenusAchalinusPeters,1869在分类上隶属

于游蛇科FamilyColubridae,闪皮蛇亚科Subfamily

Xenodermatinae[6,7].该属的模式种是黑脊蛇(Acha-

linusspinalis).脊蛇属蛇类已知有9种,除1种外,在

中国均有分布,其中5种是中国特有种.美姑脊蛇

(AchalinusmeiguensisHuandZhao,1966)是中国的特

产蛇类,区别于其他脊蛇的主要形态特征是具鼻间

鳞和一枚极小的眶后鳞[8].目前仅见于四川的美姑、

安县、洪雅、峨眉、宝兴、汶川、卧龙、屏山等以及

云南省水富县,已报道的分布海拔在1500~3000m之

间[7,9].由于分布的局限性及生境的特殊性,关于美

姑脊蛇研究的文献很少,而且这些研究大多为形态

描述,对其生态学或者分子生物学研究尚未见报道.

本文首次报道美姑脊蛇的线粒体基因组全序列,

并通过与蛇类已有的线粒体基因组全序列比较,探

讨蛇类线粒体基因组全序列的结构及进化等特点.

闪皮蛇亚科及脊蛇属的系统发生研究中存在基因少、

支持率低等问题,本文使用线粒体基因组全序列来

进行系统分析,试图更好地解决它们的系统关系.

1材料与方法

(ⅰ)基因组DNA的提取.美姑脊蛇采自四川

省安县千佛山自然保护区,实验材料用95%的酒精

保存,标本用6%福尔马林溶液固定,并保存于四川

大学.DNA的提取参照标准酚-氯仿法进行[10],所提

取的DNA置于−20℃保存备用.

(ⅱ)引物设计.首先,使用蛇类编码基因通用引

物[11~15]扩增出美姑脊蛇的ND1,ND2,ND4和Cytb片段.

然后与从GenBank中下载的阿尔卡链蛇(Dinodonsemi-

carinatus,NC_001945)、冲绳烙铁头(Ovophisoki-

navensis,NC_007397)、瘰鳞蛇(Acrochordusgranula-

tus,NC_007400)和球蟒(Pythonregius,NC_007399)等

线粒体基因组全序列进行排列比对,选取保守性较

高的区域,设计了可以覆盖美姑脊蛇线粒体基因组

全序列的11对PCR引物(表1).

(ⅲ)PCR扩增和序列测序.PCR反应体系大概含

有约50ng的模板DNA,10×缓冲液5μL,2.5mmol/L

dNTP各2μL,引物(10pmol/L)各2.5μL,Taq聚合酶

2.0U,最后补足灭菌双蒸水至终体积.PCR反应条件

为:95℃预变性3min;94℃变性30s,48~58℃退火30s,

72℃延伸90s,35个循环;最后72℃延伸8min.为防

止污染,所有PCR反应都设立空白对照组;扩增产物

使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,用BioStarGlass-

milkDNA纯化试剂盒(加拿大)回收,纯化后的线粒体

基因使用ABI3730测序仪(美国)测序.为保证所测序

列的可靠性,每一样品均进行双向测序.

(ⅳ)序列分析.获得的序列用Blast软件与

GeneBank数据库的序列比对,以及用ClustalX1.83

软件[16]与已发表的近缘物种的线粒体基因组全序列

进行比对,编码蛋白序列的准确起止位置根据脊椎

动物线粒体基因组起止密码子确定,并使用Sequin

(Version5135)软件确定了13个蛋白质基因的位置和

DAMBE软件来计算序列的碱基组成和密码子使用频

率.通过tRNAScan-SE软件[17]定位了21个tRNA基因,

通过ClustalX1.83软件与4种蛇线粒体基因组全序

列进行比对,定位了剩余的一个tRNA-Ser(AGC)和2

个rRNA基因,并且对其余的基因位置进行了修正和

确定.tRNA的二级结构用RNAstructure4.5

(/)软

件推测.

(ⅴ)系统发育分析.从GenBank上下载16种

蛇的线粒体基因组全序列(表2),在13个编码基因中,

由于ND6在轻链编码,在核苷酸和氨基酸组成上与

其他12个编码基因差异明显,因而在构建系统发生

序列矩阵时该基因被排除[20,22,28,29].为了考察蛇亚目

的单系性,我们分别选择两栖类、龟类、鳄鱼类、鸟

类、蜥蜴等类群的代表种作外类群(表2).

系统发育分析分别采用最大简约法(maximum

表1美姑脊蛇线粒体基因组全序列测定所使用的引物

引物编号上游序列(5′→3′)下游序列(5′→3′)退火温度/℃测序长度/bp

E39734/E39735TAATCTCCGTGCCAGCGACCTTCACAGGGTCTTCTGGTCTT581776

E45266/E45267GCCTGCCCAGTGAACATTGCGTTCTAGGAGGGTGAGG55779

E46268/E45269TCCGCTACGACCAACTCATTGCTCAGGCTATTAGTCAGTG521654

E40978/E40979CTTCTACAGTAAGGTCAGCTTAGTCAGTTGCCAAAGCC501847

E40980/E40981TGGACATTGACAGACGAGCTATGCGGTGGTCTACTTC491260

E54599/E54600CGATCCCTCTACCTAATAGAAGAAGTGGAGTAGGAGGATGATTTCTAGGTCAA482393

E42227/E42228ACCCACGCCCTAATACTCAATGTGGCTGATAGAGGAG521919

E42229/E42230CATCTCTGACTACCAAAAGCGTCCAATGTCTCCGATACG511435

E42046/E42047CAACGAACAAGACATCCGTCCACCAGGTTGAGATGTT521398

E42231/E45098CATCCTACGCTCTATCCCATGGTAGTCAGGTGAAAGG48995

E45099/E42232CCACTGGTTACACTCTCAAGGTGATTAGTTTGGCTTATGG501020

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2009年5月第54卷第9期

表2本研究所用的线粒体基因组序列

物种名称GenBank登录号来源及出处

AcrochordusgranulatusNC_007400[18]

AgkistrodonpiscivorusNC_009768[5]

BoaconstrictorNC_007398[18]

CylindrophisruffusNC_007401[18]

DeinagkistrodonacutusNC_010223

YanJ,etal.未发表

DinodonsemicarinatusNC_001945[3]

EnhydrisplumbeaNC_010200

YanJ,etal.未发表

EunectesnotaeusAM236347[19]

LeptotyphlopsdulcisNC_005961[20]

NajanajaNC_010225

YanJ,etal.未发表

OvophisokinavensisNC_007397[18]

PantherophisguttatusguttatusAM236349[19]

PantherophisslowinskiiNC_009769[5]

PythonregiusNC_007399[18]

RamphotyphlopsbraminusNC_010196

YanJ,etal.未发表

XenopeltisunicolorNC_007402[18]

PelomedusasubrufaNC_001947[21]

DoganiasubplanaNC_002780

FarajallahA,etal.未发表

IguanaiguanaNC_002793[22]

SceloporusoccidentalisNC_005960[20]

RhineurafloridanaNC_006282[23]

GeocalamusacutusNC_006285[23]

CorvusfrugilegusNC_002069[24]

ViduachalybeataNC_000880[25]

SmithornissharpeiNC_000879[25]

AcanthisittachlorisNC_003128[26]

AlligatorsinensisNC_004448

WuX,etal.未发表

GavialisgangeticusNC_008241

已投稿

XenopuslaevisNC_001573[27]

Achalinusmeiguensis

本研究

parsimony,MP)和贝叶斯法(Bayesianinference,BI)进

行分析.MP分析在PAUP*4b10软件[30]中完成.分析

选择启发式搜索(heuristicsearch)、树二等分再连接选

项(tree-bisectionreconnection,TBR)和100次随机加

入序列(additionsequencereplicates)等参数进行搜索

最大简约树.所有位点均作无序特征处理,分析前排

除所有无信息位点.检验MP树中各节点可信度采

用非参数自展法(non-parametricbootstrap)重复检测,

参数设定:nreps=1000,search=heuristic,conlevel=

50,addseq=random,swap=TBR.

贝叶斯分析采用MrBayes3.1.2软件[31],以后验

概率(posteriorprobability,PP)来表示各分支的可信度.

替代模型根据MODELTESTv.3.7软件[32]中等级似然

率(hLRT)和AIC检验标准来选择替代模型.起始树设

为随机树,马尔科夫链的蒙特卡洛方法设置为4条链

同时运行3×106代,3条热链1条冷链.每100代对系

统树进行抽样,最终得到30001棵系统发育树,重复

一次以确保MCMC的收敛.将运行过程中所得的冷

链对数似然值(log-1ikelihoodscores)与相应的代数进

行作图,找到对数似然值达到饱和的位置,到达饱和

前的数据被作为老化样本(burninsamples)而舍弃.在

舍弃老化样本后,根据剩余的样本构建一致树

(consensustree)并计算相关参数.

(ⅵ)系统发育树检测.系统发育树构建完毕后,

采用Shimodaira-Hasegawa(SH)检测[33]判断不同构树方

法所构成的系统发育树之间是否收敛;而从一系列相

互竞争的拓扑树或系统育假设中选择最优的系统发育

树时,Shimodaira-Hasegawa检测和approximatelyunbi-

ased(AU)检测[34]两种统计检验同时被采用,前者包

含在PAUP*4.0b10软件中,后者则通过CONSEL0.1f

软件[35]完成,并且所有统计检验都是基于同一核苷

酸替代模型,即GTR+G+I模型(根据等级似然率和

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AIC选择标准选择最适合的替代模型).

(ⅶ)美姑脊蛇分化时间.为了检验是否偏离分

子钟,将有分子钟约束的ML树与不受分子钟约束的

ML树的似然对数值进行比较[36];如果两者差异显著,

则分子钟被拒绝.对数似然比检验表明,不同谱系联合

线粒体蛋白编码基因数据(χ2=1443.035,df=28,P<

0.001)序列的分子钟假设被拒绝,不宜采用全局分子

钟(globalclock)来估算分支时间.

因此本研究采用松散分子钟约束的Bayesian方法

[37]和罚分似然法[38]估算分支之间的分歧时间.这两种

方法都放宽了对严格分子钟中系统发育类群间相同的、

稳定的替代速率的约束,而是允许数个分子钟及分化

时间校正.Bayesian方法在MULTIDISTRIBUTE软

件[39]中执行,并将不同基因、不同进化谱系的进化速

率的差异进行整合.这一分子钟估算方法的运算过

程可以分为两步:第一步,从数据和基于F84+G进化

替代模型获得的稳定拓扑结构的系统树中,运行

ESTBRANCHES来估计分支的枝长.这一过程允许

位点进化速率按照分散的γ分布而变异,这一分布

依照4种替代形式速率的方差-协方差数据矩阵计算

[40,41].F84+G进化替代模型中的参数用PAML软件的

BASEML程序[42]来估计.第二步,用MULTI-DIV-

TIME[39]估算分化事件的时间及标准差,并且通过

MarkovchainMonteCarlo方法来估算95%水平的置

信区间.Markov链运行100000代,在舍弃初始的

300000次循环的代数后,每100代抽样一次.在运行

MCMC之前,我们先对根节(treeroot)年龄、根节速

率以及分支自主相关速率的平均值及标准误等参数

进行预设:以300Mya前(标准误SD=50Mya)作为

根节到顶端分化时间的期望值(rttm=300),但不对

节点分化时间进行限定;每位点每百万年0.002655

的替换(SD=0.002655)作为treeroot节点的进化速率

(rtrate=0.002655;rtratesd=0.002655);系统树上沿着

衍生枝,控制每百万年速率与分支自主相关程度尺

度的参数设置为.0361(brownmean=0.0361,

brownsd=0.0361).根节到顶端的分化时间最大可能

值设置为350Mya(bigtime=350).为检测Markov

chainMonteCarlo的收敛性,这一过程以不同的起始

树至少运行2次.

0

MULTIDIVTIME程序允许对标定点进行最大、

最小时间尺度的限定.本研究采用两个校正点:

(1)蛇类和蜥蜴类分化时间大约在130~150Mya[43];

(2)Acanthisittachloris,Corvusfrugilegus和Viduacha-

lybeata的分化时间最少82Mya[44].

罚分似然法在R8S软件[45]中执行,该种方法通过

最优树的枝长来推算分支之间的分化时间,采用

Powell和TN方法进行优化,最佳平滑值由交叉验证

法(Cross-validation)获得.同时,分子钟的分化时间

校正也采用以上两个标定点.

2结果与分析

2.1美姑脊蛇mtDNA结构

美姑脊蛇线粒体基因组序列全长为17239bp,

为一环形的双链DNA(图1).与大多数蛇类的基因组

成及顺序相同[3],美姑脊蛇线粒体基因组由13个蛋

白编码基因,22个tRNA基因和2个rRNA基因(16S

rRNA和12SrRNA)组成.其中主链(majority-strand),

即H-链编码了29个基因,而次链(minority-strand),L-

链包含了8个基因.另外将在tRNA-Ile和tRNA-leu间

以及tRNA-Pro和tRNA-Phe间区域的1062和1063bp

确定为两个非编码区(non-codingregion),即控制区

(controlregion,CR).

(ⅰ)蛋白编码基因.在13个蛋白质编码基因

图1美姑脊蛇(Achalinusmeiguensis)线粒体基因组基因

构成

tRNA基因以相应氨基酸的单个大写字母表示.其他基因的缩写

分别为:ND1~6为NADH脱氢酶亚基1~6;COⅠ~Ⅲ为细胞色素氧

化酶亚基Ⅰ~Ⅲ;ATP6~8为腺苷三磷酸酶亚基6~8;Cytb为细胞

色素b.O

H

和O

L

分别表示重链和轻链的复制起点

1253

2009年5月第54卷第9期

1254

中,除ND6定位在轻链外,其他均定位在重链上.这

些基因都没有内含子,有些与其他基因有少许重叠

(表3).细胞色素氧化酶亚基Ⅱ和Ⅲ(COⅡ,COⅢ),

ND4,ND4L,ND5,ATPase6和Cytb等蛋白编码基因

以ATG为起始密码子,COⅠ和ATPase8以GTG为

起始密码子,ND1,ND2,ND6和ND3则分别以ATA

和ATT为起始密码子,这与其他蛇亚目种类对起始

密码子的选择无显著差异.终止密码子包括4个TAA

和4个AGG,某些蛋白编码基因如ND1,ND2,COⅢ,

ND3,Cytb等则使用了非标准终止密码子,即不完全

终止密码子T.

美姑脊蛇线粒体基因组13个蛋白编码基因的密

码子使用情况如表4.对于氨基酸四重简并的位点,

碱基C出现的频率最高,其次是T或A.而两重简并

的位点,碱基C出现的频率稍高于T.除了氨基酸

Arg密码子外,碱基G在其他密码子第三位上都是最

少的,这种低G偏倚现象在脊椎动物中很普遍.在美

姑脊蛇蛋白编码基因中,C的含量最高,平均为

32.8%;G的含量最低,平均仅为13.7%,蛋白质编码

基因密码子的第一、第二和第三位点的A+T的平均

百分含量(50.7%,57.8%,52.2%)均高于G+C含量,

其中第二位点占的比例最高(57.8%).这一点与线粒

体基因组有高AT偏向性的特征是吻合的.

(ⅱ)RNA基因.美姑脊蛇含有的22个tRNA基

因,可以满足线粒体蛋白质翻译中所有密码子的需

要,其长度为49bp(tRNA-Cys)~73bp(tRNA-Leu,

tRNA-Asn).其中tRNA-Glu,Ala,Asn,Cys,Tyr,Ser,

Gln,Pro由L-链编码,其余由H-链编码.H-链编码的

tRNA基因散布于蛋白质基因和rRNA基因之间,相

邻基因间隔1~30个碱基或紧密相连,甚至也发生重

叠.一般说来,脊椎动物的线粒体tRNA-Met,His,

Leu(CUN)等序列保守性最高,可达80%以上,而

表3美姑脊蛇线粒体蛋白编码基因

基因/区域起始位置终止位置间隔(+)/重叠(−)起始密码子终止密码子序列长/bp氨基酸(aa)编码链a)

ND125453493ATAT++949318H

ND248265849ATAT++1024341H

COI62107810+1GTGAGG1601533H

COII79368622+4ATGAGG687229H

ATPase886868853GTGTAA16856H

ATPase688449518

−10

ATGTAA675225H

COIII951810301

−1

ATGT++783261H

ND31036210704ATTT++343114H

ND4L1076911059ATGTAA29197H

ND41105912411

−1

ATGAGG1353451H

ND51260414352+1ATGTAA1749583H

ND61434814851

−5

ATAAGG504167L

CYTb1492416040+1ATGT++1117372H

a)H,重链;L,轻链

表4美姑脊蛇蛋白质编码基因碱基使用a)

物种基因

T%C%A%G%(A+T)1%(A+T)2%(A+T)3%

ND125.432.029.113.552.455.855.3

ND222.035.629.712.757.151.346.6

CO125.730.025.318.949.855.348.2

CO222.232.728.316.741.759.950.2

ATP819.631.035.114.350.053.660.7

ATP625.235.527.411.948.559.250.4

CO325.431.824.718.145.859.744.8

ND323.035.626.215.242.648.257.1

ND4L24.832.128.314.852.662.943.8

ND423.134.829.112.946.151.958.7

ND524.033.430.711.957.958.048.0

ND617.028.151.33.761.376.567.1

美姑脊蛇Achalinusmeiguensis

Cytb26.433.826.813.152.958.747.9

平均

23.432.830.213.750.757.852.2

a)(A+T)1%,(A+T)2%,(A+T)3%分别指蛋白质编码基因密码子的第一、第二和第三位点的A+T的百分含量

tRNA-Ser(AGY)的变异最大,同源性只有54%~64%.

Mt-tRNA可形成典型的三叶草形二级结构,一般含

有7个碱基的氨基酸接受臂,5个碱基的TΨC臂,反

密码子臂及4个碱基的双氢尿嘧啶(DHU)臂,各臂碱

基对存在高比例的错配.

美姑脊蛇线粒体基因组包含了两条rRNA基因,

分别是16SrRNA和12SrRNA.其位置与其他蛇类相

同.16SrRNA和12SrRNA基因序列分别为1486和

933bp,这两个基因A+T含量分别为56.6%和51.1%,

均高于各自G+C含量(43.4%和48.9%).

(ⅲ)非编码区.至今为止,蛇亚目中已测的

mtDNA全序列,除Leptotyphlopsdulcis,Ramphotyph-

lopsbraminus和Typhlopsmurius有一个控制区外,其余

种类都有两个完全复制的控制区[5].美姑脊蛇也有两

个控制区,占全序列的12.4%,这个区域富含AT(A+

T为62.5%).由于缺少编码序列所具有的碱基约束性,

控制区被认为是线粒体基因组中变异最大的部分[46].

但是在所有脊椎动物线粒体控制区也存在若干共同

的保守区,如重链复制起点以及重链和轻链转录的

驱动子[47].控制区通常分为3个区域:终止序列区、

中央序列区和保守序列区[48].这3个区域中,碱基T

的含量变化不大,保持在35.4%~37.8%之间;碱基A

的平均含量在终止序列区(30.2%)和保守序列区

(28.9%)稍高于中央保守区(27.2%);而碱基G的含量

最低,在7.6%~11.8%之间,这与整个线粒体基因组

序列相似.

2.2系统发育关系

最大简约分析产生了1个最简约的系统发育树,

树长为52912,CI=0.3203,RI=0.4361.图2显示了

50%主要合意树.简约分析支持蛇亚目为一个单系群,

支持率为100%.钩盲蛇和细盲蛇形成姊妹群,支持

率为100%,处于基部.其他蛇类可以分为两个主要

分支:分支Ⅰ包括美姑脊蛇(Achalinusmeiguensis)、

瘰鳞蛇(Acrochordusgranulatus)、黄水蚺(Eunectes

notaeus)、球蟒(Pythonregius)、闪鳞蛇(Xenopeltis

unicolor)、红尾筒蛇(Cylindrophisruffus)和巨蚺(Boa

constrictor),支持率仅为43%;分支Ⅱ包括玉米蛇

(Pantherophisguttatus)、Pantherophisslowinskii、半

棱链蛇(Dinodonsemicarinatus)、冲绳烙铁头(Ovophis

okinavensis)、铅色水蛇(Enhydrisplumbea)、印度眼镜

蛇(Najanaja)、尖吻蝮(Deinagkistrodonacutus)和食鱼

蝮(Agkistrodonpiscivorus),支持率为100%.在分支

Ⅰ中,黄水蚺和巨蚺有最近共同祖先(BP=100%),

它们与由闪鳞蛇、球蟒和红尾筒蛇组成的单系群(BP

=80%)构成姊妹群,支持率为98%.这个类群再和由

美姑脊蛇与瘰鳞蛇组成的亚枝互为姊妹群关系.在

分支Ⅱ中,蝰科形成一单系群,与由眼镜蛇科和游蛇

科的种类构成姊妹群.游蛇科铅色水蛇与眼镜蛇科

的印度眼镜蛇有最近的共同祖先,但支持率仅为

49%.

Bayesian分析方法所揭示的蛇类系统发育关系

与最大简约分析结果相似(图3).蛇亚目构成一个单

系群,得到高的后验概率支持(PP=1.00).不同于最

大简约树,基于形态学划分的盲蛇下目(Scoleco-

phidia)、原蛇下目(Henophidia)和真蛇下目(Caeno-

phidia)[49,50]各自形成单系群,瘰鳞蛇处于真蛇下目的

基部,其次是美姑脊蛇,它与蝰科、眼镜蛇科和游蛇

科组成的单系群互为姊妹群,后验概率为1.00.无论

是最大简约分析,还是Bayesian分析,两种系统发育

分析方法都较好地解决了蛇类下目间的系统发育关

系.

2.3分子钟估算

依据系统发育统计检验结果(表5),我们选择

Bayesian树来进行分歧时间的估算.如材料和方法中

所阐述,树中分支节点的分歧时间的估算是在松散

分子钟约束下,采用Bayesian方法分析完成的.估算

出蛇亚目的分化时间在128.03Mya,其95%置信区

间为124.32~131.60(C2,表6,图4).原蛇下目与真

蛇下目的分化时间为109.50Mya,其95%置信区间

为106.07~113.71(C3,表6,图4);而瘰鳞蛇与其他

真蛇下目种类的分化时间为106.18Mya,其95%置

信区间为103.17~110.22(C4,表6,图4);美姑脊蛇

的分化时间在103Mya(C5,表6,图4);蝰科与眼镜

蛇科和游蛇科构成的单系群的分化时间发生在96.06

Mya(C6,表6,图4),这与蝰科的化石记录一致.

3讨论

3.1蛇类线粒体基因组进化特点

在已测出全序的17种蛇中,除了属于盲蛇下目

Leptotyphlopsdulcis,Ramphotyphlopsbraminus和

Typhlopsmurius有单一的控制区,其他种类都具有双

控制区,并且控制区加倍事件发生约为128Mya

(95%置信区间:124.32~131.60).这与Dong等人[18]的

观点不一致.由于控制区加倍事件不仅仅在蛇亚目

1255

2009年5月第54卷第9期

图2采用PAUP*4.0b10软件的最大简约法所构建的最大简约一致树

基于13个线粒体蛋白编码基因序列的联合数据.Treelength=52912,CI=0.3203,RI=0.4361.节点处的数值代表1000次重

复抽样所得的自展支持率

种类存在,而且在蜥蜴和龟等其他爬行动物也出现

过[51~53].因此,这个事件在爬行动物进化历史中独立

地发生,有不同的演化历史.

在有些蛇类的第二个控制区(CRⅡ)侧翼含有一

个Apro(tRNA-pseudo)假基因[2,3,5,18,19].通过序列比

较发现,假基因仅出现在大多数的真蛇下目种类中,

在盲蛇下目、原蛇下目以及真蛇下目中较原始的类群

如瘰鳞蛇中未发现这个假基因.据此推测,tRNA假

基因是在真蛇下目中进化形成的,这个事件发生在

96Mya(95%置信区间:95.03~98.91),在游蛇科和蝰

科分化之前.美姑脊蛇没有发现Apro假基因,因此可

以进一步说明美姑脊蛇可能是真蛇下目中较原始的

类群,可能与瘰鳞蛇有更近的系统发育关系.

典型的脊椎动物线粒体tRNA基因的长度为

59~75bp[54],本研究中美姑脊蛇tRNA最短的49bp

(tRNA-Cys),最长的73bp(tRNA-Leu,tRNA-Asn),明

显短于一般脊椎动物.Kumazawa等人[2,3]认为,TΨC臂

的缩短和缺失是造成该现象的主要原因,我们通过研

究发现,除了TΨC臂的相对较短(一般少于5bp)外,

与其他脊椎动物一样,缺失“DHU”臂[48,55],从而

1256

图3采用GTR+G+I进化模型进行Bayesian分析所得的50%多数一致树

基于13个线粒体蛋白编码基因序列的联合数据.节点处的数值为该节点的后验概率

表5基于联合数据矩阵的蛇亚目各种系统发育假设的统计检验结果a)

−lnLΔlnL

SHAUwSHKH

Bayesian206092.92554best0.981.00.94

ML206098.113175.160.800.0620.2180.06

MP206127.3365434.4110.120.02*0.049*0.018*

Acrochordusgranulatus,nsis206113.3587520.4330.270.080.100.06

nsis,Caenophidia206204.73579111.810.00*<0.01*0*0*

nsis,Henophidia206142.7253849.7990.01*<0.01*<0.01*0*

nsis,Scolecophidia206178.7064385.7810.00*<0.01*<0.01*0*

nsis,Najanaja206130.4773537.5520.10<0.01*0.035*0.01*

a)*,数据比较差异显著(P<0.05)

1257

2009年5月第54卷第9期

表6基于联合数据矩阵的Bayesian松散分子钟估算的分歧时间以及95%置信区间

后验分歧时间

节点

时间/Mya

SD95%CI

PL

C1148.508041.43164(144.70950,149.96130)149.29

C2128.022981.84106(124.32289,131.59667)136.60

C3109.492121.94583(106.07292,133.70649)110.89

C4106.178371.79985(103.16504,110.22145)105.52

C5102.999531.70577(100.17461,106.87422)100.88

C696.055751.05125(95.03028,98.91085)98.24

C788.935442.23792(84.08853,93.06151)95.00

C865.781735.75942(53.01370,75.50340)67.61

C920.078525.41546(9.76417,30.36626)27.29

C1082.746933.28289(75.46274,88.28126)82.00

C1164.004656.09093(50.63093,74.51996)62.11

C1251.565856.39901(37.69466,62.62928)56.63

C13102.627862.72198(97.16197,107.82987)99.46

C1478.538946.09655(64.99476,88.80835)77.19

C1596.132433.54611(88.54137,102.42330)99.46

C1686.700144.28593(76.95398,93.96931)83.37

C17123.804191.94522(119.94754,127.61041)129.03

图4采用Bayesian分析基于松散分子钟方法估算蛇亚目种类的分化时间

表示用于分子钟校正的标定信息

1258

形成二叶草结构,也是造成蛇类tRNA短的重要原因.

类似现象还出现在鳄类等爬行动物中[56~58].

3.2系统发育分析

基于传统形态学研究,蛇类被划分为3类:盲蛇

下目(Scolecophidia)、原蛇下目(Henophidia)和真蛇下

目(Caenophidia)[49,50].我们的BI分析结果有力支持

了这3个类群的单系性,并且支持盲蛇下目最先分化

出来,原蛇下目和真蛇下目互为姊妹群.

在真蛇下目中,瘰鳞蛇(Acrochordusgranulatus)

是一种分化较早的蛇类,这一点已经得到普遍的认

可[59~63].有关脊蛇的系统发育位置却存在很大的争

议,脊蛇最初被归类到游蛇科(Colubridae)闪皮蛇亚

科(Xenodermatinae)脊蛇属(Achalinus).近年来,闪皮

蛇亚科被认为是真蛇下目(Caenophidia)中较原始的

种类,分化时间仅次于瘰鳞蛇类[62,64,65].Kraus等人[59]

根据闪皮蛇亚科形态学特征以及与瘰鳞蛇类之间的关

系,建议将其归入瘰鳞蛇超科(“Acrochordoidea”).Vidal

等[65]则把闪皮蛇亚科提升为闪皮蛇超科(“Xenoderma-

toidea”).Lawson等人[66]基于Oxyrhabdiumleporinum的

Cytb和C-mos基因片段,认为闪皮蛇亚科(Xenoder-

matinae)应归于眼镜蛇科(Elapidae).从我们的系统发

育关系来看,不支持美姑脊蛇归属于游蛇(Achalinus

rufescens)科或者眼镜蛇科(表5,P<0.01);也不支持

与瘰鳞蛇有更近的系统发育关系,但是所有统计检

验都不拒绝美姑脊蛇和瘰鳞蛇构成姊妹群(表5,P>

0.05).基于ND4基因序列分析,Vidal等人[62]认为瘰

鳞蛇、棕脊蛇Achalinusrufescens和Xenodermus

javanicus聚类在一起,但节点并没有得到强烈支持.

由于测全序的蛇种类有限,目前的研究无法准确判

断瘰鳞蛇和美姑脊蛇之间的系统发育关系.最后,由

于美姑脊蛇与真蛇下目中蝰科、游蛇科以及眼镜蛇科

之间的单系性都被统计检验拒绝(表5,P<0.01),因此,

我们认为美姑脊蛇所在的闪皮蛇亚科应该提升到科

或者更高的分类阶元.

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